背景：大腦作為人類(lèi)功能活動(dòng)的“總部”，損傷后的再生和修復是當今科學(xué)界面臨的難題。腦神經(jīng)元具有難以再生的遺傳特性以及創(chuàng )傷性腦損傷（TBI）后的抑制性微環(huán)境是神經(jīng)修復的關(guān)鍵困難。

因此，TBI后功能恢復的重點(diǎn)是促進(jìn)損傷后的神經(jīng)再生，創(chuàng )造合適的微環(huán)境。越來(lái)越多的證據證明，使用干細胞來(lái)源的外泌體比直接移植干細胞可以在治療TBI方面帶來(lái)更多益處，為神經(jīng)再生創(chuàng )造新的治療途徑。

神經(jīng)干細胞外泌體成為治療創(chuàng )傷性腦損傷的新策略

自1987年Johnstone首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現外泌體并將其命名為“外泌體”以來(lái)，目前用于腦再生的無(wú)細胞治療策略已經(jīng)得到發(fā)展。該領(lǐng)域取得了顯著(zhù)的進(jìn)展，特別是在TBI再生修復中的應用。我們對外泌體生物學(xué)效應理解的進(jìn)展對再生醫學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，它們可以廣泛用作腦修復細胞信號傳導的有效介質(zhì)。研究證實(shí)，外泌體對于大腦內外的細胞間通訊至關(guān)重要，表明外泌體不僅在細胞內短距離傳輸信號，而且還通過(guò)腦脊液廣泛傳播到整個(gè)大腦。

近日，國際《Stem Cell Research&Therapy》期刊發(fā)表了一項《神經(jīng)干細胞來(lái)源的外泌體成為創(chuàng )傷性腦損傷的無(wú)細胞治療策略》的綜述，該綜述首先描述了神經(jīng)干細胞外泌體的基本特征和生物學(xué)效應。其次，總結了神經(jīng)干細胞分泌的外泌體在TBI診斷和治療中的作用及其可能機制。最后，討論了神經(jīng)干細胞外泌體治療創(chuàng )傷性腦損傷所面臨的挑戰。

神經(jīng)干細胞與外泌體概述

外泌體是細胞分泌的小囊泡，攜帶生物信息，并通過(guò)內體和質(zhì)膜途徑產(chǎn)生。外泌體不僅可以作為疾病診斷和治療的生物標志物，而且可以作為細胞間通訊的主要媒介。此外，外泌體在膜細胞向細胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)和核糖核酸（RNA）的運輸中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。外泌體的生物發(fā)生包括其內容物以及隨后的途徑和機制。

神經(jīng)干細胞可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，以替代因損傷而受損或耗盡的神經(jīng)細胞。因此，神經(jīng)干細胞可以作為一種天然的活躍活性資源，并被認為是治療TBI的潛在工具。大量研究發(fā)現神經(jīng)干細胞移植可以顯著(zhù)再生受損組織。NSC分泌的外泌體被認為可以增加基于干細胞的治療的優(yōu)勢，因為它們能夠克服其母體神經(jīng)干細胞移植治療的風(fēng)險和困難。

有人提出神經(jīng)干細胞外泌體可以自由穿透血腦屏障（BBB）、抑制細胞凋亡、介導免疫調節、抑制炎癥和調節自噬。神經(jīng)干細胞外泌體作為無(wú)干細胞治療策略，可以滿(mǎn)足修復和再生治療的需求，成為T(mén)BI治療的非常有前景的候選者。

外泌體含量及鑒定

外泌體富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)，在調節細胞生理功能、影響細胞間信息傳遞中發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要的作用。人們普遍認為，外泌體成分可能因其來(lái)源和細胞類(lèi)型而異。外泌體已被鑒定含有4563個(gè)蛋白質(zhì)、764個(gè)miRNA、1639個(gè)mRNA和194個(gè)脂質(zhì)。

值得注意的是，人類(lèi)神經(jīng)干細胞（hNSCs）除了表達外泌體的常見(jiàn)標記蛋白CD63和CD81外，還表達神經(jīng)干細胞的標記蛋白c-MYC蛋白。第二代測序顯示，hNSC外泌體所含的miRNA與其他來(lái)源的miRNA不同。hNSCs分泌的miRNA有113種，其中高表達的miRNA有5種，包括hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4508、hsa-miR-4492和hsa-miR-4516。作為高表達的miRNA之一，miR-1246是一種p53靶向miRNA，在調控細胞發(fā)育和凋亡方面發(fā)揮著(zhù)重要作用。另一項研究表明，miR-21a在NSCs分泌的外泌體中高表達，可促進(jìn)神經(jīng)細胞的分化和再生（圖1）。

神經(jīng)干細胞外泌體可能通過(guò)作用于周?chē)毎麃?lái)發(fā)揮作用。例如，神經(jīng)干細胞衍生的外泌體，尤其是miR-9，通過(guò)抑制Hes1促進(jìn)NSC分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。此外，外泌體分泌的miR-150-3p通過(guò)靶向CASP2來(lái)防止神經(jīng)元凋亡，或者高水平的miR-21a可以促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元，從而導致膠質(zhì)疤痕減少

外泌體的發(fā)生途徑和機制

外泌體作為細胞內的主要通訊媒介，可以通過(guò)不同途徑與靶細胞結合以傳遞信息。目前普遍認為外泌體的生物合成主要涉及質(zhì)膜途徑和內體途徑。在內體途徑中，早期內體從質(zhì)膜出芽形成早期內體；隨后，早期內體萌發(fā)腔內囊泡（ILV）形成多囊泡體（MVB），最后，MVB與質(zhì)膜融合釋放外泌體。此外，一些證據已經(jīng)證實(shí)外泌體可以直接從質(zhì)膜出芽，即質(zhì)膜途徑。

目前，研究最多的外泌體生物發(fā)生途徑是內體途徑。細胞質(zhì)膜內陷可形成早期內體，早期內體（Rab5為標志物）通過(guò)酸化和物質(zhì)交換成熟為晚期內體（Rab7為標志物）。晚期內體最終可以形成含有ILV的MVB，ILV由多泡膜向內萌芽的凹陷構成。多囊泡通過(guò)與溶酶體或自噬溶酶體融合而被降解，與細胞質(zhì)膜融合導致管腔囊泡分泌到細胞外，最終形成直徑范圍為40至160nm的外泌體（圖2）。

外泌體的純化和儲存

由于外泌體體積小、密度低且成分相似，外泌體的分離對其分離提出了巨大的挑戰。NSCs和其他細胞分泌的外泌體的常見(jiàn)分離方法主要包括超速離心、超濾和尺寸排阻層析、聚合物沉淀、免疫親和捕獲層析和微流控芯片分離。在這些方法中，超速離心是最常用的方法，目前被視為外泌體提取的金標準。此外，不同的分離技術(shù)也會(huì )影響外泌體的生物活性。因此，標準化的分離流程和定量方法對于外泌體質(zhì)量和臨床應用至關(guān)重要。

對于外泌體的保存條件來(lái)說(shuō)，能夠在體外保持外泌體的完整性也是極其重要的。一些研究表明，不同的儲存條件可能會(huì )影響外泌體的大小，但對外泌體攜帶的貨物沒(méi)有太大影響。數據顯示，在37°C下儲存兩天后，外泌體大小減少了約60%。4℃保存兩天后外泌體大小基本保持不變，而3~4天后外泌體大小明顯下降。有趣的是，外泌體的形態(tài)和大小在?20°C下保存可以保持一個(gè)月。迄今為止，仍缺乏證據表明外泌體可以在體外穩定保存很長(cháng)時(shí)間，因此在體外維持外泌體完整性的挑戰仍然嚴峻。

神經(jīng)干細胞外泌體的生物學(xué)效應

神經(jīng)干細胞分泌的外泌體參與了中樞神經(jīng)系統中神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞之間的多種相互作用。此外，神經(jīng)干細胞分泌的外泌體可將活性物質(zhì)從神經(jīng)元轉移到星形膠質(zhì)細胞，從而調節星形膠質(zhì)細胞的功能、突觸活動(dòng)、神經(jīng)血管完整性和髓鞘化。一方面，NSCs分泌的外泌體可將特定顆粒從原始細胞攜帶到靶細胞，導致病理變化加劇，如阿爾茨海默?。ˋD）中的淀粉樣β蛋白（Aβ）和tau蛋白β、海綿狀腦病中的朊病毒蛋白和帕金森?。≒D）中的α-突觸核蛋白。另一方面，神經(jīng)干細胞外泌體可作為神經(jīng)保護因子，促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生和神經(jīng)損傷修復。

神經(jīng)干細胞外泌體治療創(chuàng )傷性腦損傷的機制

先前的一項研究表明，神經(jīng)干細胞有望成為實(shí)驗模型和臨床實(shí)踐中TBI治療的有效策略。然而，最近已經(jīng)證明，神經(jīng)干細胞與創(chuàng )傷性腦損傷后腦重塑和功能恢復相關(guān)的主要機制并不依賴(lài)于細胞替代效用，而是可能依賴(lài)于旁分泌效應，例如神經(jīng)干細胞分泌的外泌體。

近期研究證實(shí)，神經(jīng)干細胞外泌體作為信號分子的載體，參與介導腦損傷后病理過(guò)程中神經(jīng)細胞的通訊，通過(guò)調節神經(jīng)細胞間的信息通訊參與TBI后損傷的發(fā)生和修復。細胞。小RNA測序、蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及精選miRNA和蛋白質(zhì)的驗證證明，人iPSC衍生的NSC的外泌體富含參與促神經(jīng)再生、抗凋亡、抗炎癥、抗氧化作用、血腦屏障修復的miRNA和蛋白質(zhì)此外，它們還含有促進(jìn)突觸可塑性和增強認知功能恢復的miRNA和/或蛋白質(zhì)（圖3）。

• NSCs分泌的外泌體含有多種細胞活性成分，可以自由穿過(guò)血腦屏障、抑制炎癥反應和神經(jīng)細胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生和血管生成等。
• 針對神經(jīng)再生，NSCs分泌含有circAcbd6的外泌體，進(jìn)一步促進(jìn)NSCs的分化通過(guò)miR-320-5p/氧甾醇結合蛋白相關(guān)蛋白2軸進(jìn)入膽堿能神經(jīng)元。
• NSC衍生的外泌體含有抑制炎癥反應、下調TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子表達并促進(jìn)小膠質(zhì)細胞從M1向M2表型極化的成分。
• 抗凋亡后，NSC分泌的外泌體轉移miR-150-3p（一種富集的miRNA），并抑制神經(jīng)元凋亡。NSC外泌體引起的自噬標記蛋白LC3B和beclin-1表達增加也減少了神經(jīng)細胞的凋亡。為了促進(jìn)血管生成，神經(jīng)干細胞外泌體可以上調VEGF水平，從而加速血管生成。

工程神經(jīng)干細胞外泌體針對腦損傷的潛在治療作用

由于其獨特的納米結構、缺乏免疫原性、低毒性、良好的滲透性，具有穿越血腦屏障的能力，加之它們在組織再生、免疫等方面的重要作用，調控和疾病識別，外泌體在中樞神經(jīng)系統損傷的治療中具有巨大的治療潛力，但天然外泌體的靶向能力較差，從而大大降低了治療效果。

工程化外泌體具有主動(dòng)靶向特定細胞類(lèi)型和組織的能力。納米技術(shù)的發(fā)展為靶向藥物遞送帶來(lái)了新的希望，基于外泌體結構和功能的納米制劑有望克服中樞神經(jīng)系統障礙，將神經(jīng)保護分子轉移至腦實(shí)質(zhì)，為針對腦區域的治療提供有效的治療手段中樞神經(jīng)系統損傷疾病。

制備工程外泌體的策略之一是細胞工程。親代細胞的基因工程是常用的細胞工程技術(shù)之一，即在外泌體生物發(fā)生過(guò)程中直接修飾外泌體。

外泌體工程學(xué)是即在適當條件下利用特定技術(shù)對純化的外泌體表面蛋白或內容物進(jìn)行修飾，主要分為孵育法、物理法、皂化法和表面修飾法。與細胞工程的低效率和高難度相比，直接修飾純化的天然外泌體可以直接獲得大量工程外泌體，減少細胞培養過(guò)程中的不確定性，對工程外泌體的大規模生產(chǎn)具有重要意義（圖4）。

前景和挑戰

與大多數外泌體類(lèi)似，神經(jīng)干細胞分泌的外泌體在腦損傷的治療中具有以下優(yōu)勢。

• 首先，外泌體是納米大小的囊泡，可以順利穿過(guò)血腦屏障并且易于吸收，靜脈注射后小血管閉塞的可能性非常低。
• 其次，外泌體負責細胞間的傳遞，當腦損傷發(fā)生時(shí)，內源性NSCs釋放外泌體，向其他細胞傳達需要救援的信息，實(shí)現受損大腦的修復和再生。
• 第三，NSCs分泌的外泌體具有低免疫原性，為神經(jīng)系統疾病提供了一種無(wú)細胞療法，且沒(méi)有明顯的副作用。
• 第四，與干細胞培養和保存的難度相比，植入后生長(cháng)的風(fēng)險無(wú)法控制，并且由于懷疑形成腫瘤，干細胞外泌體可以在制劑中儲存并注射到血液中，很容易被利用吸收。

鑒于此，研究神經(jīng)干細胞外泌體為優(yōu)化基于細胞的療法提供了見(jiàn)解，并有助于理解腦損傷后基于外泌體療法的再生和修復的確切機制。

神經(jīng)干細胞分泌的外泌體在再生治療領(lǐng)域顯示出前景，包括TBI的治療。盡管TBI治療中神經(jīng)干細胞衍生的外泌體研究的數量不斷增加且取得了有希望的結果，但臨床前和臨床研究的轉化研究仍有很長(cháng)的路要走。

目前，尚缺乏安全、有效、高產(chǎn)的外泌體生產(chǎn)和純化方法，限制了外泌體用于疾病治療的臨床轉化。因此，應深入探討神經(jīng)干細胞外泌體的純化和保存方法標準，以確保獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量的外泌體，促進(jìn)神經(jīng)干細胞外泌體用于TBI治療的臨床轉化。

盡管目前NSC外泌體的臨床轉化面臨挑戰，但除了基因修飾外，神經(jīng)干細胞外泌體還可以與載藥納米粒子結合，發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，賦予神經(jīng)干細胞外泌體未來(lái)更廣闊的發(fā)展前景。

結論

總之，目前最有希望的腦損傷治療方法之一是基于神經(jīng)干細胞外泌體給藥。由于大腦神經(jīng)損傷后神經(jīng)干細胞外泌體具有有益作用，因此有必要探索神經(jīng)干細胞外泌體調節神經(jīng)再生的潛在機制。

神經(jīng)干細胞來(lái)源的外泌體治療腦損傷的潛在機制可能是由于其神經(jīng)再生、抗炎、血管生成和抗凋亡特性（圖3）。此外，考慮到神經(jīng)干細胞的工程化外泌體可能會(huì )在不同水平上影響腦功能，不同治療途徑（靜脈內、鼻內或原位）的TBI療效也有所不同。因此，根據TBI患者的需求定制神經(jīng)干細胞外泌體治療策略對于增強基于外泌體的無(wú)細胞療法的效果至關(guān)重要。

參考資料：Zhong, L., Wang, J., Wang, P. et al. Neural stem cell-derived exosomes and regeneration: cell-free therapeutic strategies for traumatic brain injury. Stem Cell Res Ther 14, 198 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03409-1

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