間充質(zhì)干細胞移植是一種治療慢性肝病的新興療法。臨床前和臨床研究已經(jīng)評估了這種療法的潛力。盡管間充質(zhì)干細胞移植的機制仍未完全明了，但不斷積累的證據顯示，間充質(zhì)干細胞的免疫調節、分化和抗纖維化特性在肝臟再生中發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要的作用。許多臨床研究已觀(guān)察到間充質(zhì)干細胞對慢性肝病患者的安全性和治療效果。然而，由于目前移植細胞的可行性有限，治療效果僅略有改善。

在此，我們討論了幾種旨在提高細胞移植活力的策略，以及未來(lái)使用基于細胞外囊泡的療法治療肝病的潛在挑戰。

介紹

慢性肝損傷，例如由病毒感染、酗酒或代謝性疾病引起的肝損傷，會(huì )導致肝硬化和衰竭。終末期肝硬化的最終治療方法是肝移植。然而，在許多國家，移植并不容易獲得，而在可以進(jìn)行移植的國家，器官短缺和與移植相關(guān)的高昂費用使得這對許多患者來(lái)說(shuō)是不切實(shí)際的選擇。

干細胞移植已被提議作為肝病患者預防進(jìn)展和治療晚期纖維化患者的潛在策略。干細胞移植，包括造血干細胞、誘導多能干細胞和間充質(zhì)干細胞 (MSC)，可被操縱分裂成肝細胞樣細胞體外和體內。在這些細胞類(lèi)型中，MSC已被證明具有相對容易獲得和具有低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。它們具有自我更新能力，可以分化成各種譜系的細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。此外，間充質(zhì)干細胞在倫理方面是安全的，因為它們并非源自體細胞。此外，間充質(zhì)干細胞移植被認為是安全的，并在各種疾病的臨床環(huán)境中進(jìn)行了廣泛評估，并取得了有希望的結果。

本綜述的目的是介紹間充質(zhì)干細胞在肝臟疾病中的治療效果，以解決有關(guān)有效性、安全性和可能涉及的風(fēng)險的問(wèn)題，并討論基于間充質(zhì)干細胞的臨床治療的最新臨床進(jìn)展，為進(jìn)一步治療肝病開(kāi)辟新的道路。

間充質(zhì)干細胞移植概述

間充質(zhì)干細胞移植的定義和來(lái)源

間充質(zhì)干細胞可以分化為中胚層或外胚層細胞，從而產(chǎn)生貼壁的多能成纖維細胞型干細胞。不同的研究人員以不同的方式定義MSC特征。為了解決這個(gè)問(wèn)題，國際細胞治療學(xué)會(huì )推薦了一組三個(gè)標準來(lái)定義人類(lèi)間充質(zhì)干細胞：粘附性、特異性表面抗原表達和多能分化潛能（表1）。

MSC可以從大多數器官或組織中分離出來(lái)，包括骨髓（BM）、臍帶血（UCB）、脂肪組織（AT）、外周血、骨小梁、滑膜、軟骨和肌肉。其中，三個(gè)主要來(lái)源已被證明能夠治療肝?。築M-MSC、UCB-MSC和 AT-MSC。一般來(lái)說(shuō)，眾所周知，這三種來(lái)源的間充質(zhì)干細胞表達相似的表面抗原，但它們的形態(tài)和增殖率各不相同。

間充質(zhì)干細胞移植治療肝病的治療機制

1) 轉分化為肝細胞樣細胞

源自間充質(zhì)干細胞的肝細胞樣細胞被認為是肝臟再生的替代來(lái)源。MSC的肝分化受到多種因素的影響。首先，間充質(zhì)干細胞可以通過(guò)多種細胞因子和生長(cháng)因子處理，如肝細胞生長(cháng)因子（HGF）、成纖維細胞生長(cháng)因子-2/4、表皮生長(cháng)因子、制瘤素M、白血病抑制因子、地塞米松、胰島素等，分化為肝細胞樣細胞。此外，與肝細胞和沉淀培養物共培養可以誘導MSC分化為肝細胞樣細胞。然而，在臨床前環(huán)境中，MSC轉分化為肝細胞的比例不到肝臟總質(zhì)量的1%。應開(kāi)發(fā)更有效的肝細胞分化技術(shù)，利用肝細胞分化的MSC治療肝臟疾病。

2）免疫調節

炎癥引起的慢性肝損傷伴隨著(zhù)T細胞、B細胞和單核細胞的浸潤（圖1）。

據報道，免疫抑制劑有利于肝移植前后的肝再生。在這方面，間充質(zhì)干細胞的免疫調節特性可以對肝臟疾病產(chǎn)生有利的影響。首先，間充質(zhì)干細胞可以通過(guò)釋放各種可溶性因子來(lái)下調T細胞，例如一氧化氮、前列腺素E（PGE）-2、吲哚胺2,3-雙加氧酶、白細胞介素（IL）-6、IL-10和人白細胞抗原G。這些因子可以控制各種免疫細胞的增殖和功能，并上調Treg細胞。MSC 還可以通過(guò)直接與 T 淋巴細胞相互作用來(lái)抑制T細胞的增殖。

MSCs的免疫抑制能力是由干擾素-γ、IL-1a和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子的組合產(chǎn)生的。這些細胞因子幫助一些趨化因子和免疫細胞與MSC保持接觸并調節免疫反應。此外，MSC可以抑制B細胞的活化，降低免疫球蛋白的水平。最后，MSC已被證明可以誘導炎癥巨噬細胞向替代巨噬細胞極化。這種改變釋放出可改善肝損傷的可溶性因子（即IL-10和IL-1Ra）。

3) 抗纖維化活性

慢性肝損傷導致靜止的肝星狀細胞 (HSC) 轉分化為纖維化肌成纖維細胞，產(chǎn)生過(guò)量的ECM蛋白并導致纖維化。MSC治療可通過(guò)間接或直接細胞間接觸來(lái)減弱活化HSC的增殖和膠原蛋白沉積。在間接接觸機制中，MSC分泌的幾種可溶性因子（即TNF-β3、TNF-α、IL-10和HGF）會(huì )減弱膠原合成，而HGF和神經(jīng)生長(cháng)因子則誘導HSC凋亡。接下來(lái)，與HSC共培養的MSC通過(guò)細胞間接觸抑制HSC的增殖和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (SMA) 的表達。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和MMP組織抑制劑（TIMP）有助于肝纖維化的進(jìn)展和消退。在一些纖維化模型中，MSC調節M(mǎn)MP（即MMP-2、-9、-13和-14）和TIMP-1的表達。增加MMPs的表達并減少TIMPs的表達。

我們準備好在常規臨床實(shí)踐中進(jìn)行間充質(zhì)干細胞移植了嗎？

間充質(zhì)干細胞移植的有效性和安全性現狀

多項臨床試驗已經(jīng)闡明了間充質(zhì)干細胞治療慢性肝病的優(yōu)勢（表2）。

Study (year)	Liver disease	Patients, sample size (MSC/control)	Cell source	Graft type	Injection route	Cell doses	Duration of follow-up (mo)	Primary outcomes
Mohamadnejad et al. (2007)	Decompensated LC	4/0	BM	Auto	PV	31.7×106	12	MELD score, liver function test, and liver volumes
Kharaziha et al. (2009)	LC (MELD ≥10)	8/0	BM	Auto	Portal vein (n=6)	3.0–5.0×107	6	MELD score, liver function test, and serum creatinine
or PV (n=2)
Amer et al. (2011)	Chronic HCV-associated LC	20/20	BM	Auto	1) IS (n=10)	2.0×107	6	MELD score, Child-Pugh score, ascites, edema, liver function test, and fatigue
2) IH (n=10)
Peng et al. (2011)	Chronic HBV-associated liver failure	158/0	BM	Auto	HA	1.0×106	12	MELD score, liver function test, and self-reported symptoms
El-Ansary et al. (2012)	Chronic HCV-associated LC	15/10	BM	Auto	PV	1.0×106	12	MELD score and serum albumin level
Shi et al. (2012)	Chronic HBV-associated liver failure	24/19	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	MELD score, liver function test, and survival rates
Zhang et al. (2012)	Chronic HBV-associated decompensated LC	30/15	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	MELD score, ascites, and liver function test
Amin et al. (2013)	Chronic HCV-associated LC	20/0	BM	Auto	IS	1.0×107	6	MELD score and liver function test
Mohamadnejad et al. (2013)	Decompensated LC	15/12	BM	Auto	PV	1.0×106	12	No improvement
Wang et al. (2013)	UDCA-resistant PBC	7/0	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	Serum alkaline phosphatase and γ-GT levels
Jang et al. (2014)	Alcohol-related LC	11/0	BM	Auto	HA	5.0×107	4	MELD score and liver histology
Salama et al. (2014)	Chronic HCV-associated LC	20/20	BM	Auto	PV	1.0×106	6	MELD score and Child-Pugh score
Wang et al. (2014)	UDCA-resistant PBC	10/0	BM	Allo	PV	3.0–5.0×105	12	Serum levels of ALT, AST, γ-GT, and IgM
Xu et al. (2014)	Chronic HBV-associated LC	27/29	BM	Auto	HA	8.45×105	6	MELD score improvement and reduction in IL-6, IL-17, TNF-α levels
Suk et al. (2016)	Alcohol-associated LC	37/18	BM	Auto	HA	5.0×107	12	Child-Pugh score and Histologic fibrosis
Lanthier et al. (2017)	Decompensated alcoholic hepatitis	28/30	BM	Auto	HA	4.7×107	1	No improvement
Lin et al. (2017)	Chronic HBV-associated liver failure	56/54	BM	Allo	PV	1.0×106	6	MELD score and survival rates
Detry et al. (2017)	Liver transplant recipients	10/9	BM	Allo	PV	1.5–3.0×106	12	No difference of rate of infection or de novo cancer

Mohamadnejad進(jìn)行的一項試點(diǎn)研究等人。2007年的第35次研究表明，輸注自體間充質(zhì)干細胞治療四名失代償性肝硬化患者是安全可行的。6個(gè)月時(shí)，四分之三的患者的終末期肝病模型 (MELD) 評分有所改善，其中兩人在12個(gè)月內保持穩定。

Amer進(jìn)行的一項2期研究中等人。2011年發(fā)表的第37篇文章中，40名丙型肝炎相關(guān)肝硬化患者被隨機分為兩組，每組20名患者：第一組接受自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細胞，第二組接受最佳支持治療。與第二組相比，第一組的Child-Pugh和MELD評分顯著(zhù)改善，并維持了6個(gè)月。

施等人報道，24名乙型肝炎相關(guān)慢性肝衰竭患者接受靜脈UCB-MSC輸注治療，19名患者接受生理鹽水治療作為對照。UCB-MSC輸注顯著(zhù)提高了72周的存活率，并且直到隨訪(fǎng)結束才觀(guān)察到明顯的副作用。

阿明也得到了類(lèi)似的結果等人研究表明，脾內自體移植改善了20名丙型肝炎相關(guān)性肝硬化患者的肝功能，具體表現為總膽紅素、天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸氨基轉移酶水平和凝血酶原時(shí)間顯著(zhù)降低，凝血酶原時(shí)間顯著(zhù)增加。

Jang發(fā)表的開(kāi)放標簽試驗等人。2014年的45項研究表明，通過(guò)肝動(dòng)脈進(jìn)行自體BM-MSC移植治療酒精濫用相關(guān)的肝硬化具有有益效果。54.5%的患者觀(guān)察到組織學(xué)改善；第二次注射后12周，Child-Pugh評分從7.1提高到5.4，纖維化相關(guān)標志物包括TNF-β1、1型膠原和α-SMA的水平顯著(zhù)下降。

最近，一項隨機2期試驗報道，對72名酒精相關(guān)性肝硬化患者進(jìn)行肝動(dòng)脈注射自體BM-MSC可以減輕肝纖維化并改善Child-Pugh評分。

最近的一項臨床研究還報告了肝移植受者接受間充質(zhì)干細胞治療的可行性、安全性和耐受性（n=10）。間充質(zhì)干細胞治療已被認為對缺血/再灌注損傷具有潛在的有益作用。這項研究為利用間充質(zhì)干細胞作為未來(lái)潛在的治療方法為需要終生免疫抑制的肝移植受者開(kāi)辟了道路。

然而，兩項臨床研究獲得了陰性結果。穆罕默德內賈德等人報告稱(chēng)，與對照組（n=12）相比，通過(guò)外周靜脈注射的自體BM-MSC移植（n=15）可能沒(méi)有任何有益效果。在12個(gè)月的隨訪(fǎng)中，MSC 治療組和對照組之間 Child-Pugh 評分、MELD 評分、血清轉氨酶水平和肝臟體積的絕對變化沒(méi)有差異。

另一項研究報道，28名酒精性肝炎患者接受了自體BM衍生的CD34⁺治療干細胞和間充質(zhì)干細胞以及30名患者僅接受支持療法。4周隨訪(fǎng)時(shí)肝活檢中增殖性肝細胞數量?jì)山M間無(wú)顯著(zhù)差異。然而，與接受標準治療的患者相比，接受干細胞治療的患者表現出更活躍的肝臟巨噬細胞擴張。

大多數研究表明干細胞療法對于肝病患者是安全有效的。然而，許多此類(lèi)臨床研究的試驗設計的規模和性質(zhì)意味著(zhù)無(wú)法得出有意義的結論，因此其療效尚未得到證實(shí)。

間充質(zhì)干細胞移植途徑

關(guān)于移植的間充質(zhì)干細胞的植入存在相互矛盾的數據，并且對其纖維化潛力提出了一些擔憂(yōu)。這些不良影響似乎取決于間充質(zhì)干細胞輸注的途徑和劑量。盡管據報道效果因注射途徑而略有不同，但間充質(zhì)干細胞可以通過(guò)靜脈注射、肝內注射、腹膜內注射、脾內注射或門(mén)靜脈注射移植到肝臟中。外周靜脈被認為是最常見(jiàn)的移植途徑，其次是肝動(dòng)脈、脾內注射、肝內注射和門(mén)靜脈。通過(guò)外周靜脈施用的BM-MSC已被證明在慢性損傷的情況下可以很好地遷移到肝實(shí)質(zhì)中體內。

相比之下，在急性損傷環(huán)境中觀(guān)察到有限的MSC植入。此外，當通過(guò)肝內動(dòng)脈注射時(shí)，間充質(zhì)干細胞在肝組織中持續存在，這表明間充質(zhì)干細胞是存在的，并且不會(huì )分化為肝細胞。此外，在臨床試驗中，門(mén)靜脈輸注比外周途徑更有效。然而，直接方法，例如通過(guò)門(mén)靜脈或肝動(dòng)脈，可能會(huì )帶來(lái)細胞注射后門(mén)靜脈高壓出血的風(fēng)險?？傮w而言，到目前為止，大多數臨床研究提供的證據還相當缺乏。

間充質(zhì)干細胞移植的潛在風(fēng)險

迄今為止，關(guān)于MSC治療慢性肝病的臨床和臨床前研究已經(jīng)開(kāi)展，但必須謹慎考慮幾個(gè)問(wèn)題，包括致癌和病毒傳播的可能性。間充質(zhì)干細胞可以分泌多種生長(cháng)因子，促進(jìn)腫瘤細胞生長(cháng)和血管生成。先前的實(shí)驗研究表明，惡性形成的傾向取決于傳代次數。例如，在小鼠間充質(zhì)干細胞中，傳代超過(guò)3次后就觀(guān)察到染色體異常和轉化為惡性細胞，例如肉瘤。此外，MSC可能在多次傳代后表現出端粒缺失。盡管臨床試驗中尚未觀(guān)察到人類(lèi)間充質(zhì)干細胞的惡性轉化，但由于隨訪(fǎng)時(shí)間太短，大多數人間充質(zhì)干細胞的腫瘤發(fā)生并不明顯。因此，在MSCs移植前必須分析染色體完整性，以確保手術(shù)的安全性。

與自體移植相反，同種異體移植可能存在病毒傳播給患者的風(fēng)險。盡管已證明細小病毒B19可以病毒傳播至 BM細胞體外, B19陽(yáng)性MSC相關(guān)病毒血癥尚未在人類(lèi)中報道。然而，目前尚無(wú)關(guān)于單純皰疹病毒（HSV）和巨細胞病毒（CMV）通過(guò)間充質(zhì)干細胞傳播的信息體內。因此，由于免疫抑制患者存在感染的可能性，MSC受體和供體可能都需要進(jìn)行細小病毒B19、HSV和CMV篩查。

肝病間充質(zhì)干細胞移植的未來(lái)方向

臨床研究表明僅具有中等益處，至少部分是因為無(wú)論細胞來(lái)源如何，移植細胞的活力有限。甚至有報道稱(chēng)，由于移植時(shí)遇到的微環(huán)境缺乏靈活性，移植細胞的存活率不到1%。在本節中，我們將回顧用于提高 MSC移植中細胞治療效果的策略（圖2）。

1. 組織工程

組織工程方法的目的是讓細胞在開(kāi)始再生之前在移植器官中歸巢和適應，從而提高細胞存活率。ECM在細胞組織和功能中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。已經(jīng)研究了多種方法，包括共培養和3維 (3D) 系統的開(kāi)發(fā)。在3D系統中生長(cháng)的細胞可能表現得更像細胞體內并直接植入。這些3D系統可分為基于支架的系統和無(wú)支架系統。

幾種合成聚合物，包括聚乳酸共乙醇酸 (PLGA) 和天然材料，如膠原蛋白，已被評估其在肝分化過(guò)程中增加 MSC中肝細胞特異性基因表達的能力。事實(shí)上，在PLGA支架上共培養BM來(lái)源的MSC和分離的新鮮肝細胞時(shí)，顯示了肝功能的調節。使用MSC與肝細胞比例為1:5時(shí)觀(guān)察到的性能效果最大體外和體內。除了基于支架的3D系統外，多個(gè)小組還評估了生物支架（例如脫細胞組織）的作用。脫細胞肝組織形成ECM支架，可以通過(guò)提供更生理的環(huán)境來(lái)改善MSC植入。

2. 預處理提高細胞抵抗力

在治療過(guò)程中，間充質(zhì)干細胞被移植到病理疾病條件下。換句話(huà)說(shuō)，病理條件使植入的細胞面臨嚴重的酸性、氧化和營(yíng)養應激。在這方面，移植前修飾供體細胞有助于這些細胞抵抗惡劣條件，從而改善細胞功能。幾種預處理策略包括通過(guò)將細胞暴露于物理或環(huán)境沖擊以及目標分子的藥理學(xué)調節劑來(lái)促進(jìn)廣泛的促生存反應。

3. 基因工程

已經(jīng)研究了幾種方法來(lái)促進(jìn)參與供體細胞歸巢的蛋白質(zhì)的表達。MSC已被證明表達低水平的分子，包括歸巢因子、基質(zhì)細胞衍生因子1和趨化因子受體（即CXCR4和CCR1受體）。對促存活或抗凋亡基因（包括 Bcl-2、蛋白激酶 B (Akt/PBK)、HGF 和存活蛋白）進(jìn)行基因操作可提高 MSC 存活率體內。眾所周知，miRNA可以調節mRNA，調節細胞基因網(wǎng)絡(luò )，包括那些參與細胞存活的基因網(wǎng)絡(luò )。miRNA過(guò)度表達已被證明可以提高M(jìn)SC的存活率。然而，在應用基因操作時(shí)必須仔細考慮幾個(gè)問(wèn)題，包括致癌風(fēng)險。

4. 細胞外囊泡作為無(wú)細胞療法

間充質(zhì)干細胞可以分泌具有旁分泌作用的可溶性分子或釋放更復雜的結構，稱(chēng)為細胞外囊泡（EV）。EV通過(guò)與細胞表面相互作用、內化或與細胞膜融合來(lái)發(fā)揮許多作用。這些EV可以被設計來(lái)改善預期活性的表達或引入特定的效應分子。

結論

間充質(zhì)干細胞再生療法通過(guò)其免疫調節、分化和抗纖維化特性對慢性肝病有效。許多臨床研究已證明間充質(zhì)干細胞可通過(guò)改善組織纖維化和改善肝功能來(lái)治療受損的肝細胞。然而，仍然存在一些問(wèn)題，包括遷移率低、細胞存活率低以及致癌和病毒傳播的風(fēng)險。我們回顧了幾種增強其功效的策略，包括改變培養環(huán)境和/或啟動(dòng) MSC以及細胞基因工程。此外，MSC產(chǎn)生的EV似乎通過(guò)保留細胞的至少一些免疫調節特性，作為基于MSC的移植中的無(wú)細胞細胞療法具有治療益處。

基于間充質(zhì)干細胞的慢性肝病細胞療法的前景將取決于細胞來(lái)源、培養條件、給藥途徑的標準化以及未來(lái)大規模臨床試驗的結果。

主要參考文獻：

Kang SH, Kim MY, Eom YW, Baik SK.  Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Liver Disease: Present and Perspectives.  Gut and Liver 2020;14:306-315.  https://doi.org/10.5009/gnl18412

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