帕金森氏病 (PD) 是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其隱含特征是黑質(zhì)致密部 (SNpc) 中多巴胺能 (DA) 神經(jīng)元逐步喪失，并明確表現為運動(dòng)遲緩、強直、靜止性震顫和姿勢不穩。

目前，可用的治療方法主要是姑息策略，包括 L-3,4-二羥基苯丙氨酸 (L-DOPA) 替代療法、DA 受體激動(dòng)劑和深部腦刺激 (DBS) 程序。然而，隨著(zhù)疾病的進(jìn)展，藥物治療效果不可避免地會(huì )消失，更糟糕的是，運動(dòng)反應振蕩的副作用以及 L-DOPA 誘發(fā)的運動(dòng)障礙 (LID)。因此，上述令人沮喪的狀況推動(dòng)了向細胞替代療法 (CRT) 的轉變，一種有前途的恢復療法，旨在確?；颊甙Y狀的持久緩解。

2016年5月31日，華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院在國際期刊《Parkinson’s disease and age-related movement disorders》上發(fā)布了一篇《帕金森病干細胞制備及應用概述：現狀及未來(lái)前景》的研究結果。

目前，研究最多的用于DA神經(jīng)元衍生的干細胞來(lái)源是人胎兒腹側中腦（hfVM）細胞、人胚胎干細胞（hESCs）、人神經(jīng)干/前體/祖細胞（hNSCs/hNPCs）、人間充質(zhì)干細胞(hMSCs)、人誘導神經(jīng)干細胞 (hiNSCs) 和人誘導多能干細胞 (hiPSCs），它們有望成為恢復性治療方案（見(jiàn)圖1)。關(guān)于PD，估計SN中 30%的DA細胞損失以及紋狀體DA神經(jīng)元神經(jīng)支配減少60%以上可導致臨床特征的出現。

因此，任何類(lèi)型的CRT方案都需要將黑質(zhì)紋狀體系統至少恢復到正常水平的30%才能有效。為了保證未來(lái)基于干細胞的CRT的標準化和均質(zhì)化，理想的評估標準應符合以下協(xié)議：

1. 產(chǎn)生足夠的可用于移植的神經(jīng)譜系特異性細胞系；

2. 植入后細胞的持續存活（即數年）；

3. 分化成足夠數量（大約 100,000 個(gè)）的黑質(zhì) DA 神經(jīng)元，并有證據表明移植細胞釋放多巴胺；

4. 這些細胞移植后的行為恢復；

5. 沒(méi)有證據表明腫瘤形成或分化為進(jìn)一步破壞黑質(zhì)紋狀體回路的神經(jīng)元/細胞；

6、符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規范（GMP）標準；

在這篇綜述中，我們建議詳細介紹干細胞系的制備和應用，尤其是用于PD研究和治療的ESC、NSC/NPC、iNSC、MSC和iPSC（見(jiàn)圖1）。由于更優(yōu)越的多能性、更獨特的分化特征和更多認可的來(lái)源，iPSC似乎是更優(yōu)先的CRT候選者。此外，還將闡述PD患者實(shí)用干細胞治療的現狀、未來(lái)前景和CRT相關(guān)炎癥問(wèn)題。

胚胎干細胞 (ESC)

ESCs來(lái)源于發(fā)育中囊胚的內部團塊，在某些正常情況下具有自我更新和產(chǎn)生所有三個(gè)主要胚層——外胚層、中胚層和內胚層的細胞的潛力（見(jiàn)圖1）。

在體外誘導ESC進(jìn)一步分化的嘗試涉及幾種不同的方法（參見(jiàn)圖2）。

整個(gè)過(guò)程分為以下三個(gè)步驟： (1) 從胚泡內塊分離胚胎干細胞；(2) 通過(guò) (i) 應用形態(tài)發(fā)生素或可溶性生長(cháng)因子誘導ESC分化為DA神經(jīng)元；(ii) 飼養細胞共培養；(iii) 遺傳操作；(iv) 底板譜系誘導策略；(3) 通過(guò)功能整合和內源性NPCs動(dòng)機在PD治療中移植誘導的DA神經(jīng)元。

例如，通過(guò)應用多種形態(tài)發(fā)生素如全反式維甲酸 (RA)、聲波刺猬 (SHH)、成纖維細胞生長(cháng)因子 (FGF)、表皮生長(cháng)因子 (EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白，顯著(zhù)改善了神經(jīng)譜系誘導(BMPs) 和神經(jīng)膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養因子（GDNF）所有這些都用作神經(jīng)源性刺激物，這對于正常的胚胎發(fā)育和分化也是必不可少的（見(jiàn)表1）。

到目前為止，已有多項證據表明，源自ESC的富含DA的移植物在移植到PD動(dòng)物模型后通常保持其DA誘導的表型、延長(cháng)的神經(jīng)突向外生長(cháng)、表達突觸標記并產(chǎn)生相當大的行為恢復（見(jiàn)表1)。與PD動(dòng)物模型的結果類(lèi)似，接受人類(lèi)胎兒組織移植的患者表現出運動(dòng)缺陷顯著(zhù)減少，移植物存活率、多巴胺釋放和DA神經(jīng)元的突觸整合。

主要問(wèn)題

然而，與所有多能干細胞的情況一樣，hESC 可能會(huì )在預期的移植區域產(chǎn)生畸胎瘤。此外，移植的胚胎干細胞可能會(huì )穿過(guò)血腦屏障，在功能上整合到異位腦區并分泌活性因子，從而對中樞神經(jīng)系統（CNS）產(chǎn)生不良影響。此外，同種異體 hES 細胞及其衍生物在移植到受體大腦中時(shí)可能會(huì )引起免疫排斥反應。除此之外，移植物引起的肌張力障礙和運動(dòng)障礙是另一個(gè)棘手的問(wèn)題。針對以上擔憂(yōu)，未來(lái)的干細胞研究可以做些什么呢？

總的來(lái)說(shuō)，必須通過(guò)熒光激活細胞分選 (FACS)、磁激活細胞分選 (MACS)、有絲分裂阻滯和/或定向分化等方法，從最終移植產(chǎn)品中去除或減少殘余ESC至安全水平，以便減少致瘤危害。此外，對移植細胞生物分布、潛在異位毒性的評估以及對ESC衍生細胞的免疫狀態(tài)和經(jīng)歷神經(jīng)退行性損傷的CNS的了解將更好地保證基于 ESC 的 CRT 在PD中的成功。遺憾的是，由于上述潛在問(wèn)題，到目前為止，還沒(méi)有美國食品和藥物管理局 (FDA) 批準使用 hESC 衍生細胞在 PD 患者中進(jìn)行移植的正在進(jìn)行的臨床試驗。然而，鑒于迷人的內在分化能力和全球研究人員的共同努力，hESCs 衍生的 DA 神經(jīng)元必將達到臨床階段并轉化為臨床應用。

神經(jīng)干細胞 (NSC)

1990年代早期在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統中發(fā)現干細胞和祖細胞，挑戰了著(zhù)名科學(xué)家 Ramony等人長(cháng)期存在的“無(wú)新神經(jīng)元”學(xué)說(shuō)。打開(kāi)神經(jīng)干細胞用于PDCRT的潛力的窗口。NSCs是干細胞的一種亞型，能夠在胚胎和成人中自我更新并產(chǎn)生神經(jīng)系統的主要表型，致力于神經(jīng)譜系分化，并可能在體內形成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。

神經(jīng)干細胞移植在帕金森病治療中的制備（直接分離或誘導分化）和各自應用的流程圖

NSCs可分為三類(lèi)：（1）內源性NSCs，直接從成人CNS組織中分離（A）；

(2) 干細胞衍生的NSCs，通過(guò)不同的分化方案從各種干細胞誘導(A)；

(3) iNSC，由Sox2從小鼠或人成纖維細胞重新編程，有或沒(méi)有其他轉錄因子(B); 所有這些都可以進(jìn)一步分選和純化以獲得可行的NSCs。

其中，干細胞衍生的神經(jīng)干細胞可以通過(guò)以下兩種方案進(jìn)一步誘導分化為多巴胺神經(jīng)元：（i）添加生長(cháng)因子、神經(jīng)營(yíng)養因子、細胞因子等。培養基誘導神經(jīng)球形成；(ii) 與永生化 NSC 系共培養以引入基因修飾因子。當將上述可行的NSCs和感受態(tài)DA神經(jīng)元應用于PD的CRT治療時(shí)，可以觀(guān)察到改善的神經(jīng)元存活狀態(tài)和恢復性功能缺陷。

PD是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，被認為是受影響大腦區域NSCs池缺乏的結果，是CRT的合適候選者。因此，高度期待將NSCs（內源性NSCs、iNSCs或干細胞衍生的神經(jīng)干細胞）替換到受損大腦中作為PD的可能治療手段（見(jiàn)圖1）。在成功建立多種來(lái)源的神經(jīng)干/前體/祖細胞 (NPC/NSC) 后，快速、可靠和長(cháng)期生產(chǎn)人類(lèi)NPC對神經(jīng)科學(xué)家和臨床神經(jīng)移植試驗都具有巨大的實(shí)用價(jià)值。

PD是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，被認為是受影響大腦區域NSCs池缺乏的結果，是CRT的合適候選者。因此，高度期待將NSCs（內源性 NSCs、iNSCs或干細胞衍生的神經(jīng)干細胞）替換到受損大腦中作為PD的可能治療手段（見(jiàn)圖1）。在成功建立多種來(lái)源的神經(jīng)干/前體/祖細胞 (NPC/NSC) 后，快速、可靠和長(cháng)期生產(chǎn)人類(lèi) NPC 對神經(jīng)科學(xué)家和臨床神經(jīng)移植試驗都具有巨大的實(shí)用價(jià)值。

間充質(zhì)干細胞 (MSC)

MSCs是一種非造血多能亞型細胞系，主要來(lái)源于骨髓的基質(zhì)結構 ，而不是脂肪組織、臍帶、真皮和外周血，在體內一般分化為骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞(見(jiàn)圖1)。

一般而言，有兩類(lèi)MSC：天然MSC（直接從間充質(zhì)組織分離）和神經(jīng)誘導的MSC，它們都對PD治療具有巨大前景（見(jiàn)圖4）。其中，天然骨間充質(zhì)干細胞（BMSCs）和神經(jīng)誘導骨間充質(zhì)干細胞（BMSCs）均已通過(guò)多組PD模型的治療效果測試，均顯示移植細胞存活、TH表達和明顯的行為恢復，但神經(jīng)誘導的 BMSCs 的修復效果似乎更明顯。此外，從脂肪組織和臍帶中分離出的MSCs在PD模型中同樣顯示出有益效果。此外，基因工程MSCs也被證明在PD治療中表現出治療潛力。大量研究表明，生長(cháng)因子（特別是 GDNF、VEGF 和神經(jīng)營(yíng)養因子）的蛋白質(zhì)或基因遞送在一系列嚙齒動(dòng)物和靈長(cháng)類(lèi)PD模型中有效保護多巴胺神經(jīng)元（見(jiàn)表1）。

MSCs可分為三種類(lèi)型：na?veMSCs、神經(jīng)誘導的MSCs和基因工程的MSCs，它們都可以在移植后直接發(fā)揮內在治療作用，例如（i）分泌中性粒細胞因子、生長(cháng)因子等；(ii) 內源性 MSCs 動(dòng)機、神經(jīng)發(fā)生和血管生成；(iii) 免疫調節和抗炎作用。

此外，MSCs可以通過(guò)（i）化學(xué)刺激誘導分化為多巴胺神經(jīng)元；(ii) 基因轉染；(iii) 飼料細胞共培養；(iv) 使用條件培養基。移植后，MSCs 和分化的 DA 神經(jīng)元表現出 (a) 在毒素損傷后持續的神經(jīng)元存活；(b) 增強多巴胺神經(jīng)元再生和修復；(c) 功能缺陷恢復。

迄今為止，有以下幾種可能的潛在機制解釋了MSC 對PD的治療效果（見(jiàn)圖6）。

1. 分泌各種生長(cháng)因子、細胞因子、細胞外基質(zhì) (ECM) 蛋白和有效的神經(jīng)調節分子，為神經(jīng)再生創(chuàng )造有利環(huán)境。

2. 激活內源性恢復機制以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生并減少 DA 神經(jīng)元的損失（抗細胞凋亡）。

3.免疫調節和抗炎作用。

現狀與未來(lái)展望

作為一種有前途的恢復性治療替代方案，干細胞療法作為一種有前途的再生療法已成為PD研究領(lǐng)域的前沿，尤其是與MSC相關(guān)的療法。一方面，MSC可以很容易地獲得和擴展，而無(wú)需使用其他支持性細胞。另一方面，MSC不受與ESC相關(guān)的倫理和免疫排斥問(wèn)題的影響。

遺憾的是，觀(guān)察到的MSCs衍生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的數量相當少，無(wú)法恢復正常的細胞結構，盡管一些體內研究表明MSCs能夠在移植后分化為神經(jīng)元細胞。因此，如何在未來(lái)的研究中產(chǎn)生足夠多且特異的神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞亞型以適應細胞移植是一個(gè)需要理順的首要問(wèn)題。與ESC和NSC的情況一樣，應解決與腫瘤形成、免疫排斥和生物分布相關(guān)毒性相關(guān)的安全問(wèn)題，以便最終將MSC轉化為PD治療選擇。我們相信，盡管MSC研究仍處于臨床管道的啟動(dòng)階段，但 MSC 很有希望成為可用于PDCRT的干細胞庫的成員。

誘導多能干細胞 (iPSC)

2006年Yamanaka 等人已經(jīng)表明，ESC樣細胞可以通過(guò)逆轉錄病毒引入OSKM基因轉錄因子從胚胎和成年小鼠成纖維細胞中衍生出來(lái)，后來(lái)獲得諾貝爾獎獎勵“發(fā)現成熟的體細胞可以重新編程以重新進(jìn)入多能性”。從重編程過(guò)程中獲得的類(lèi)ESC多能細胞被稱(chēng)為iPSC（見(jiàn)圖1）。

與其他類(lèi)型的干細胞相比，iPSCs憑借更優(yōu)越的多能性、更獨特的分化特征和更容易獲得的來(lái)源，似乎是更優(yōu)先的CRT候選者。下文將進(jìn)一步闡述多種多樣的iPSCs的制備、應用、現狀、潛在挑戰和未來(lái)前景。

iPSCs在帕金森病中的應用

研究表明，基于蛋白質(zhì)的人類(lèi)iPSC很有希望成為臨床轉化的有前途的細胞來(lái)源，這些hiPSC的行為與hESC相似，沒(méi)有異常衰老/細胞凋亡，沒(méi)有顯示任何外源性重編程基因表達，并且DA神經(jīng)元來(lái)自人類(lèi)piPSC顯著(zhù)改善PD嚙齒動(dòng)物模型中的行為缺陷（參見(jiàn)表3)?？傊?，對于與PD相關(guān)的干細胞研究和治療領(lǐng)域，除了現有的基于病毒和蛋白質(zhì)的iPSCs外，還應將更多的精力和注意力投入到多元化建立的iPSCs上，這將極大地促進(jìn)CRT的進(jìn)一步發(fā)展如果實(shí)施，用于PD治療。

現狀與未來(lái)展望

一般來(lái)說(shuō)，理想的iPSCs的建立集中在適用的體細胞來(lái)源、重編程因子的適當組合、有效的遞送方法和適當的培養條件。根據iPSC的目的和應用，有關(guān)體細胞類(lèi)型、重編程因子、遞送方法和培養條件的選擇在很大程度上有所不同，其中詳細闡述了重編程因子和遞送載體。在上述協(xié)議的基礎上，已經(jīng)成功地建立了從各種體細胞到iPSC的轉分化，并且iPSC衍生的DA神經(jīng)元也被證明可以挽救PD動(dòng)物模型中的運動(dòng)缺陷。盡管取得了上述成就，但臨床上可行的iPSC的生成仍然存在局限性。

用于帕金森病治療的干細胞亞型的優(yōu)缺點(diǎn)

胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、間充質(zhì)干細胞和iPSC等多種類(lèi)型的干細胞已應用于PD相關(guān)的基礎和實(shí)驗研究，其中許多已轉化為PD模型移植，結果參差不齊。分別闡述了上述干細胞的制備、誘導分化、初步應用、當前挑戰和未來(lái)前景。然后比較干細胞亞型在PD治療中的優(yōu)缺點(diǎn)（見(jiàn)表4）。

ESCs來(lái)源于囊胚的內細胞團，可以全能分化為三個(gè)胚層，包括黑質(zhì)DA神經(jīng)。此外，ESCs衍生的DA神經(jīng)元在移植到PD動(dòng)物模型后已證明，神經(jīng)突長(cháng)出延長(cháng)，特定突觸標記物的表達和功能缺陷的緩解。然而，將這些細胞用于PD治療仍然存在一些嚴重的問(wèn)題，例如腫瘤形成的風(fēng)險、倫理問(wèn)題和免疫排斥，因此需要更多的研究以保證在PD治療中的進(jìn)一步應用。

至于NSC，與ESC相比的一個(gè)潛在優(yōu)勢是，除了神經(jīng)譜系分化受限外，它們在移植后不易形成腫瘤和引起免疫排斥反應。然而，神經(jīng)干細胞顯示出一些缺點(diǎn)，如有限的分化能力和來(lái)源、揮之不去的倫理問(wèn)題、帕金森癥狀的部分緩解。

相比之下，一些研究表明，間充質(zhì)干細胞沒(méi)有上述缺點(diǎn)，可能對神經(jīng)系統疾病具有更大的治療潛力。

結論

盡管細胞替代療法是治療帕金森和其他神經(jīng)退行性疾病的有前途的途徑，但仍然存在許多障礙，如腫瘤發(fā)生、免疫反應、低干細胞產(chǎn)量和生物分布相關(guān)的毒性，有待解決，以便能夠開(kāi)發(fā)出可以轉化為有效且普遍接受的臨床應用的新方法。除此之外，疾病階段和嚴重程度也可能對細胞替代療法的效果產(chǎn)生影響?？傊?，細胞替代療法實(shí)踐仍處于起步階段，因此我們必須在未來(lái)的研究中建立更多的干細胞系，以推動(dòng)與帕金森病相關(guān)的干細胞研究和治療從實(shí)驗室到臨床。